距离2003年人类基因组序列图绘制完成至今已近20年，这本人体“生命之书”被科研人员掀开了第一页。如今医学诊疗已迈入基因组医学时代，在“众病之王”的肿瘤诊疗领域，基因检测正帮助着千万患者和医生找到对抗疾病的方法：通过基因检测甄别出的肿瘤特异性突变，结合目前对变异已有的研究，针对性确定对特定肿瘤的治疗方案，最终让患者从诊疗中获益，也就是“采样实验”——“测序解读”——“诊断治疗”这几个重要步骤。
01 测序结果的解读数据库百花齐放，目前尚无统一标准 “测序解读”是基因组医学应用的重要环节，在测序成本不断下降，测序通量不断上升，测序准确性不断提高的当下，如何高效注释解读测序结果逐渐成为“最后一公里”挑战。在2010年-2020年间，以美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG），美国临床肿瘤学会（ASCO），美国病理学家学会（CAP），美国分子病理学协会（AMP）等专家组织基于应用需求发布多项基因测序结果解读参考指南，覆盖遗传性基因变异，肿瘤体细胞基因变异，基因拷贝数变异等变异类型。围绕基因变异注释解读环节形成了繁多应用平台诸如OncoKB，My Cancer Genome，Precision Medicine Knowledge Base，Personalized Cancer Therapy，ClViC，Jackson Laboratory Clinical Knowledgebase，Cancer Genome Interpreter等，很多平台已助力知名肿瘤诊疗机构MTB(Molecular Tumor Board，分子肿瘤专家委员会)完成诊疗流程，切实帮助了医生与患者。然而，面对百花齐放的变异解读注释平台，结果不准确会有哪些影响？不同平台注释之间一致性如何？诸如此类疑问随着测序临床应用的广泛应用也越来越多。我们将结合最新的研究通过几个部分来尝试讨论这个问题。 附表1：《JCO Precis Oncol》发表研究中关于2017年ASCO/AMP/CAP指南突变等级体系与O平台/W平台关于突变等级体系对照表。 02 不同平台注释之间一致性如何？ 《JCO Precis Oncol》于2020年刊发的一项研究，通过比较目前英文环境下三个知名注释平台：N平台，W平台以及O平台，揭开了解读注释这个临床关注环节的一角。其中前N平台和W平台为商业化肿瘤基因组测序结果注释数据库，O平台则是由MSK(Memorial Sloan Kettering)癌症中心维护的全面精准医疗肿瘤数据库。 《JCO Precis Oncol》发表研究取用的变异测试集为2015-2017年间通过NGS测序获取到的1227例样本中来源于117个基因的1388个独立变异位点，主要变异来源基因为TP53（n=270），STK11（n=92）以及CDKN2A（n=81）。样本主要癌症类型为肺腺癌（n=440），结肠腺癌（n=113）。通过对变异注释分类结果进行比较，采用Cohen's kappa系数分析研究不同平台注释结果的一致性。研究发现，对于分类为“致病”和“可能致病”变异位点，W平台和O平台之间注释结果一致性较高为76%（kappa，0.22）；W平台和N平台注释结果一致性为30%（kappa，-0.26）；N平台和O平台注释结果一致性为42%（kappa，-0.07）；对于2017 ASCO/AMP体细胞分级中Tier I级别的变异（对应O平台和W平台Level1变异位点），W平台和O平台注释一致性为96.9%，具有中等强度一致性（kappa，0.44）。同时由于N平台的注释未能提供注释结果证据级别信息，因此未能对N平台的结果和其他2个平台进行更多比较。
附图2：3个平台之间致病性注释一致性 03 解读注释结果不准确会有哪些影响？ 文献中的第一个案例来自黑色素瘤中BRAF V600R变异，OncoKB注释为Level1级别（临床相关性最高）位点，而WFG平台未将该位点作为Level1位点进行注释。研究者发现，如果只看FDA已获批的BRAF/MEK药物说明书信息，是找不到BRAF V600R变异的信息，但是根据肿瘤数据库分析发现，V600R是BRAF V600位点除V600E变异之外的重要变异类型（约占3%-7%），此外，2016年后NCCN发布临床诊疗指南，BRAF/MEK抑制剂对包含V600R，V600D等少见V600突变同样存在敏感，对携带变异的肿瘤也应推荐进行靶向治疗。同样是一个重要的变异位置，如果只注释常见的变异而未注释相同位置发生的其他少见变异的意义，会导致遗漏而对靶向治疗产生重要影响。 第二个案例来自非小细胞肺癌样本中的EGFR L861Q位点，W平台将L861Q变异注释为与吉非替尼/厄洛替尼/阿法替尼均敏感，注释等级均为Level3B。研究者发现，基于LUX-Lung系列研究，阿法替尼对L861Q等少见EGFR抑制剂存在敏感性，2018年FDA将阿法替尼药物敏感EGFR变异进行了拓展，已包含了L861Q在内的少见变异；同时更多临床研究也发现，当遇见这种L861Q等EGFR少见变异时，应该考虑二代EGFR-TKI，而非一代EGFR-TKI。如果注释结果中对这类少见变异对不同药物的敏感性不加以细分，在临床药物选择上很可能造成混淆。 金橡医学团队对于这类少见变异进行学术查询和解析，为临床医生提供更全面的变异研究信息。 图1：金橡检测报告中对EGFR L861Q少见变异的药物敏感性提示 04 金橡医学如何应对注释解读过程中的挑战 通过研究，我们能看到目前常用的不同NGS变异注释分析平台的结果存在客观一致性差异，这个差异在常见临床用药基因变异（如EGFR，BRAF等）上较小，对于其他潜在意义基因变异注释结果则存在较明显的差异，这种差异可能是由于变异分级体系，肿瘤变异所处研究阶段以及突变有害性预测方法引起。同时，能看到W平台和O平台这两个变异注释体系基于ASCO/CAP/AMP等变异解读指南的平台之间注释结果有更好的一致性，提示我们对于报告突变的注释结果一定要基于解读指南提供信息，才能更有效地帮助医生和患者对检测结果进行判断决策，这是金橡医学一直坚持的，金橡医学的检测解读围绕ACMG，ASCO/CAP/AMP等变异解读指南，持续跟进药物研究共识进展，通过专业的医学团队协同临床致力让变异检测信息得到更好的注释和解读。 和基因组测序一样，对海量测序变异的精准解读是项复杂的系统工程，唯有不断投入。相信随着新技术发展及研究深入，NGS测序结果解读注释服务在准确、全面、效率方面将会不断的提升。 参考文献 Katsoulakis E, Duffy JE, Hintze B, Spector NL, Kelley MJ. Comparison of Annotation Services for Next-Generation Sequencing in a Large-Scale Precision Oncology Program. JCO Precis Oncol. 2020 Mar 24;4:PO.19.00118. doi: 10.1200/PO.19.00118. PMID: 32923873; PMCID: PMC7446349. 
